สองปีผ่านไป การเป็นสไปเดอร์แมนทำให้ ปีเตอร์ พาร์คเกอร์ (โทบี้ แม็คไกวร์) ต้องเสียสละและสูญเสียคนรอบข้างที่เขารักมากมาย แม้แต่ แมรี่ เจน วัตสัน (เคิร์สเทน ดันสต์) ซึ่งกำลังจะหมั้นกับนักบินอวกาศ และเขาอาจสูญเสียเธอไปตลอดกาล เมื่อความกดดันถึงที่สุด เขาเลือกที่จะไม่เป็นสไปเดอร์แมนอีกต่อไป แต่เมื่อเพื่อนสนิท แฮร์รี่ ออสบอร์น (เจมส์ ฟรังโก้) ซึ่งยังคงอาฆาตแค้นสไปเดอร์แมนที่ทำให้พ่อเขาตาย โดยดึง “ด็อค อ๊อคก์” (อัลเฟร็ด โมลิน่า) ศัตรูทรงพลังรายใหม่ มาต่อกรกับสไปเดอร์แมน สไปเดอร์แมนจะต้องเลือกระหว่างการมีชีวิตปกติหรือแบกรับภาระ อันยิ่งใหญ่ในฐานะฮีโร่